¿Qué es la electroforesis en gel? ¿Cómo y por qué es útil?

La electroforesis en gel es una técnica de referencia para la separación de ácidos nucleicos basada en la carga y el tamaño en biología. Esta separación forma la base de varios experimentos biológicos.

A menudo leemos sobre científicos que trabajan con ADN, extrayendo ADN de diferentes muestras, manipulándolos, uniéndolos, cortándolos en pedazos más pequeños usando enzimas, etc. El requisito previo para todas estas técnicas es poder visualizar el ADN.

¿Alguna vez te has preguntado cómo visualizan los científicos esta pequeña molécula de ADN? Bueno, la respuesta es “electroforesis”.

Es un método para separar biomoléculas cargadas como ADN, ARN y proteínas utilizando electricidad. Arne Tiselius utilizó la electroforesis para separar moléculas biológicas por primera vez en 1931. Aunque ha pasado casi un siglo, la técnica de electroforesis sigue siendo una técnica importante y la única forma de separar biomoléculas complejas.

¿Cuál es el principio detrás de esta técnica?

El principio principal detrás de la “electroforesis” es utilizar electricidad para separar las biomoléculas en función de su carga y Talla. La separación se basa en el simple hecho de que “las cargas iguales se repelen y las cargas opuestas se atraen”.

La mayoría de las biomoléculas están cargadas, positiva o negativamente. El ADN y el ARN tienen carga negativa debido a los grupos fosfato presentes en su estructura, mientras que las proteínas pueden ser positivas o negativas dependiendo de los aminoácidos que las componen.

Si esta separación se realiza en un medio gelatinoso generalmente hecho de agarosa (un polímero de carbohidrato), es electroforesis en gel de agarosa.

¿Qué es la electroforesis en gel en gel?

El gel en la electroforesis en gel se refiere a la matriz en la que se separan las biomoléculas. Es de naturaleza clara y gelatinosa, como la gelatina que consumimos.

La matriz más utilizada para la electroforesis es el polisacárido agarosa. Quizás se pregunte por qué se usa agarosa en esta técnica. Hay dos razones. Uno es su capacidad para formar una malla (entrecruzamiento). La matriz de agarosa actúa como un tamiz o malla, a través de la cual las biomoléculas pueden viajar fácilmente, en función de sus tamaños. La segunda razón es su naturaleza neutra, que asegura que no haya reacción entre la agarosa y las biomoléculas a separar, minimizando las posibilidades de resultados falsos.

Veamos la configuración de la electroforesis en gel para comprender cómo se produce la separación.

Cámara de electroforesis con electrodo de alimentación sumergido en la solución tampón y gel de muestra colocado

El diagrama muestra un sistema de electroforesis con cátodo y ánodo colocados en una solución de electrolito (tampón). Los pocillos de muestra se utilizan para cargar las muestras biológicas que se van a separar. (Crédito de la foto: M. PATTHAWEE / Shutterstock)

El sistema es un tanque pequeño con dos electrodos: un ánodo (con carga positiva) y un cátodo (con carga negativa), sumergidos en una solución tampón. Esta solución tampón es a menudo un electrolito, una solución que puede conducir electricidad.

El gel se sumerge en la solución tampón. Tiene pequeños pocillos en los que se puede cargar la muestra. Los pocillos de muestra están cerca del electrodo negativo para que las muestras cargadas negativamente se muevan al electrodo positivo cuando se enciende la fuente de alimentación.

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La unidad de repetición de agarosa, se compone de D-galactosa (un azúcar) y 3,6-anhidro L-galactosa (un azúcar modificado). (Crédito de la foto: Wikimedia commons)

Las biomoléculas se mueven a través del gel en función de su cargar y Talla. Las biomoléculas cargadas negativamente se mueven hacia el terminal positivo y viceversa.

Los fragmentos más pequeños suelen tener un peso molecular bajo o son más ligeros. Esto les permite viajar rápidamente a través del gel, cubriendo una distancia mayor. Por el contrario, los fragmentos más grandes tienen un peso molecular más alto. Como resultado, se mueven lentamente a través del gel ya que el tamaño de los poros de la agarosa no permitirá que las moléculas más grandes se muevan más rápido.

El movimiento también se basa en el porcentaje de agarosa utilizado en el gel. Los geles de agarosa de bajo porcentaje tienen tamaños de poro más grandes para facilitar el movimiento rápido de moléculas más grandes. Para la separación de moléculas de ADN más pequeñas, es mejor un porcentaje más alto de gel de agarosa ya que el tamaño de poro más pequeño puede proporcionar una mejor separación.

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El diagrama muestra cómo una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se mueve a través de un gel de agarosa. Las moléculas más pequeñas viajan la distancia máxima mientras que las moléculas más grandes viajan menos. (Crédito de la foto: M. Tali Lavy / Shutterstock)

Cómo visualizar el ADN

Si miramos el tampón de electroforesis, el gel de agarosa o las muestras de ADN, todos son transparentes. Entonces, ¿cómo visualizamos el ADN? Usamos un tinte de color que se une al ADN o las biomoléculas. El tinte de unión al ADN más utilizado es el bromuro de etidio (EtBr).

El tinte se agrega al gel de agarosa o se agrega al tampón que se llena en el aparato. De cualquier manera, debería entrar en contacto con el ADN y unirse a él.

Con este tinte agregado, el gel se expone a luz ultravioleta (UV). Bajo luz ultravioleta, el bromuro de etidio libera una luz brillante. Como el etidio ya está unido al ADN, los lugares del gel que aparecen brillantes son los lugares donde está el ADN.

Siempre se deben tomar precauciones al manipular EtBr, ya que causa cáncer (carcinógeno). Debe usarse con precaución y desecharse adecuadamente.

El ADN se verá como pequeñas líneas verticales brillantes, llamadas bandas sobre un fondo oscuro. Cada banda consta de moléculas de ADN del mismo tamaño. Las bandas intactas indican ADN de buena calidad. Si el ADN es de baja calidad o tiene contaminantes, la banda de ADN no estará intacta sino que se extenderá, lo que se denomina frotis.

Si queremos determinar el tamaño o el peso molecular del ADN, podemos usar escaleras de ADN, que son muestras de ADN de tamaños conocidos disponibles comercialmente. Si cargamos la escalera de ADN junto con la muestra de ADN (cuyo peso molecular se desconoce), la distancia migrada por ambas muestras de ADN se puede comparar para determinar el peso molecular de la muestra de ADN.

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La imagen muestra todo el proceso de electroforesis en gel de agarosa. Las muestras se añaden en los pocillos de un gel de agarosa mantenido en tampón y conectado a la fuente de alimentación. Una vez que la muestra ha viajado en el gel, se obtienen imágenes bajo luz ultravioleta para determinar la calidad y cantidad de ADN. (Crédito de la foto: Soleil Nordic / Shutterstock)

¿Qué factores pueden influir en la migración del ADN en el gel?

Varios factores influirán en la forma en que el ADN puede migrar en el gel. Existe una relación inversa entre el tamaño de la molécula de ADN y la concentración de agarosa utilizada. El ADN más grande requiere concentraciones más pequeñas de agarosa y viceversa.

También depende del voltaje aplicado. Las muestras se mueven más rápido bajo alto voltaje, pero las bandas de ADN no estarán intactas. Un voltaje más bajo dará como resultado una migración más lenta del ADN, pero las bandas serán distintas. Por lo tanto, es posible que tenga que comprometerse entre el tiempo y el voltaje para una separación adecuada del ADN.

La presencia de EtBr, la calidad de la agarosa y el pH y la composición del tampón empleado también influyen en la movilidad del ADN.

Conclusión

La electroforesis en gel de agarosa es la clave y probablemente la única técnica para determinar la calidad y el tamaño del ácido nucleico en varios campos de la investigación biológica. Las últimas dos décadas han visto una evolución y desarrollos draconianos en la técnica y los casos en los que se puede utilizar.