¿Qué es una reacción en cadena de la polimerasa y cómo funciona?

Una reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un método para crear miles de copias de una hebra de ADN. Aprovecha la capacidad de las enzimas polimerasas para crear copias del material genético en condiciones de laboratorio.

El ADN (ácido desoxirribonucleico) constituye la base de innumerables estudios de investigación que involucran organismos vivos. A partir del código de ADN, podemos obtener la base genética de las enfermedades, desarrollar medicamentos, realizar pruebas forenses, identificar microbios y mucho más.

Lo más básico que se necesita para tal investigación son grandes cantidades del fragmento de ADN que se está investigando. Sin embargo, el ADN aislado de las células, tejidos o cualquier otra fuente biológica a menudo no es suficiente para el análisis. Por lo tanto, los científicos necesitan hacer más copias de ADN.

Aquí es donde entra en escena el papel crucial de la “reacción en cadena de la polimerasa”.

¿Qué es una reacción en cadena de la polimerasa?

La PCR explota la capacidad de las enzimas polimerasas para crear copias del material genético en condiciones de laboratorio.

Antes de la PCR, se hacían copias de ADN aislando un fragmento de ADN en particular e insertándolo en el genoma de las células vivas. Las células vivas replicaron el ADN insertado mientras replicaban su propio ADN. La técnica era una forma laboriosa y que requería mucho tiempo para generar copias de ADN suficientes para un estudio adicional.

Sin embargo, este ya no es el caso. La mayor parte del mérito de este avance es para Kary Mullis, quien inventó la “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) en 1983, que marcó el comienzo de la “Revolución de la biotecnología”. Hoy en día, la PCR es una técnica de laboratorio muy común, incluso en laboratorios más pequeños, y se utiliza para generar copias de ADN de forma regular.

La PCR puede hacer copias selectivas del ADN de interés a través de un proceso conocido como “fotocopiado molecular”. Una vez que se sintetizan varias copias del ADN mediante PCR, el ADN se “amplifica”.

PCR - Acrónimo de reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica in vitro que utiliza la ADN polimerasa para generar varias copias del ADN de interés. (Crédito de la foto: kozhedub_nc / Shutterstock)

¿Cuáles son los componentes de una reacción de PCR?

Los componentes clave de una reacción de PCR son el ADN molde, los cebadores, los nucleótidos y la ADN polimerasa termoestable. Aprendamos brevemente sobre cada uno de estos componentes.

El ADN de las bacterias más simples a los animales y plantas más complejos se puede utilizar para la PCR. Sin embargo, el ADN completo (ADN molde) no se somete a la PCR; solo una pequeña sección se amplificará durante el proceso.

Para que el ADN se amplifique, los cebadores, tramos cortos de nucleótidos (aproximadamente 20 pb), son muy importantes. Se utiliza un conjunto de cebadores, tanto un cebador directo como un cebador inverso. Los cebadores se unen al inicio y al final de las cadenas de ADN, lo que indica los puntos desde los cuales la cadena de ADN debe amplificarse.

Los nucleótidos utilizados para la reacción de PCR son una mezcla de las cuatro bases nitrogenadas que se encuentran en el ADN. Son adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C).

El último y más importante componente es la ADN polimerasa. Una enzima polimerasa produce nuevas moléculas de ADN al ensamblar los nucleótidos, de manera complementaria a la hebra existente. De esta manera, en realidad puede crear dos moléculas de ADN idénticas a partir de una sola hebra de ADN.

Junto con la enzima, los cofactores necesarios para la acción de la ADN polimerasa deben agregarse a la mezcla de reacción. Los cofactores son los compuestos metálicos que son críticos para la actividad enzimática. Los iones de magnesio son los cofactores de la ADN polimerasa.

La ADN polimerasa utilizada en la PCR es la ADN polimerasa termoestable (a menudo llamada polimerasa Taq) aislada de organismos termofílicos que pueden sobrevivir a altas temperaturas.

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Los componentes de una reacción de PCR incluyen el ADN molde, la ADN polimerasa Taq, MgCl2 como tampón, bases de nucleótidos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), cebador corriente arriba (directo), cebador corriente abajo (inverso) y agua ultrapura. (Crédito de la foto: Oscar Daniel Luna Ramos / Shutterstock)

¿Cuáles son los pasos de una reacción de PCR?

Ahora que conocemos todos los componentes necesarios para la PCR, veamos los tres pasos involucrados en una reacción de PCR. Los pasos son desnaturalización, recocido y extensión.

La actividad de la polimerasa depende de la presencia de ADN monocatenario al que se pueden unir los cebadores. Esto se puede lograr simplemente calentando la muestra de ADN a 94-98 ° C.

El calentamiento rompe los enlaces que mantienen unidas las dos hebras de ADN. El proceso se llama desnaturalización, ya que la molécula de ADN bicatenario se desnaturaliza a dos moléculas monocatenarias. Una hebra de ADN se denominará hebra plantilla, mientras que su par se denominará hebra complementaria.

El siguiente paso requiere que los cebadores se unan (aparezcan) al ADN molde en sitios específicos. El cebador directo se une al inicio del ADN molde (una hebra en el ADN de doble hebra) en la secuencia de nucleótidos ATG de 3 pb (codón de inicio). El cebador inverso se une al extremo de la cadena de ADN complementario (la segunda hebra del ADN de doble hebra) en las secuencias de nucleótidos de 3 pb TAG, TAA o TGA (codones de parada). El ADN entre los codones de inicio y finalización se amplifica.

El éxito de este paso depende de la secuencia del cebador y la temperatura elegida para el apareamiento, típicamente 50-65 ° C.

El último y último paso es el alargamiento o terminación, que se produce a 72 ° C, la temperatura óptima para la actividad de la polimerasa Taq. La ADN polimerasa reconocerá la región de ADN unida al cebador y agregará nucleótidos complementarios a la hebra de ADN molde. Esto ocurre hasta que encuentra el segundo cebador.

Después de una reacción de terminación exitosa, habrá dos hélices de ADN en lugar de la única hélice de ADN utilizada en la etapa inicial. En cada una de las dos hélices de ADN, una hebra será la hebra original proporcionada por la muestra de ADN. La otra hebra será la hebra complementaria sintetizada por la ADN polimerasa durante la PCR.

Reacción de PCR

Los tres pasos de la reacción de PCR son desnaturalización, hibridación y extensión o terminación. (Crédito de la foto: Flickr)

¿Cuál es el principio detrás de la amplificación de ADN mediante PCR?

Los pasos de desnaturalización, hibridación y polimerización comprenden un ciclo de PCR. Una reacción de PCR típica puede requerir de 25 a 35 ciclos para una amplificación óptima del ADN.

Al final de un ciclo, la única plantilla de ADN formará dos moléculas de ADN. Al final de dos ciclos, los dos ADN formarán cuatro moléculas de ADN que luego se amplificarán a ocho moléculas de ADN al final de tres ciclos. Al final de n ciclos, habrá 2n copias de la plantilla de ADN original.

Después de cada ciclo, el número de moléculas de ADN que pueden actuar como plantillas para el siguiente ciclo aumenta exponencialmente. Este aumento en el número de plantillas ciclo tras ciclo es la base detrás de la amplificación de moléculas de ADN en PCR.

Reacción en cadena de la polimerasa

Amplificación exponencial de las moléculas de ADN mediante la técnica de PCR (Crédito de la foto: Enzoklop / Wikimedia commons)

¿Cuáles son los pros y los contras de la PCR?

Las ventajas clave de la técnica de PCR son que es capaz de producir de millones a miles de millones de copias de ADN en cuestión de unas pocas horas. La técnica es rápida, relativamente fácil de aprender y se puede realizar en condiciones básicas de laboratorio.

La principal desventaja es que la técnica es muy sensible, por lo que la muestra utilizada para la amplificación debe estar libre de contaminantes. Incluso pequeños rastros de ADN no deseado pueden amplificarse junto con el ADN de interés, dando resultados falsos.

Otro inconveniente es el requisito de información de secuencia del ADN para diseñar cebadores. Además, los cebadores pueden aparearse ocasionalmente con los sitios incorrectos del ADN. Tal hibridación no específica de los cebadores puede resultar en la amplificación del fragmento incorrecto de ADN.

En un escenario poco común, la ADN polimerasa puede incorporar una base incorrecta, lo que lleva a un cambio en la secuencia del ADN de interés, lo que puede afectar el proceso posterior.

Para una reacción de PCR exitosa, todo lo que necesita es material genético puro, un conjunto apropiado de cebadores y una temperatura de hibridación adecuada.

¿Dónde se puede utilizar esta tecnología?

La aplicación principal de la PCR es el aislamiento selectivo de ADN a partir de muestras mixtas de ADN. Esto puede ayudar a diagnosticar enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas y varios tipos de cánceres en un período corto de tiempo. También se utiliza en ciencias forenses para identificar delincuentes y realizar pruebas de paternidad.

Constituye la base de la mayoría de las aplicaciones relacionadas con la biología molecular, la clonación de genes, la tecnología del ADN recombinante y la mutagénesis.

Conclusión

El avance práctico de la técnica de PCR simple y versátil, según lo prescrito por Kary Mullis, ha transformado drásticamente la investigación biológica. Todo lo que tenemos que hacer es mezclar todos los componentes de la PCR en las concentraciones adecuadas en un tubo pequeño, cargarlo en la máquina de PCR (termociclador) y esperar unas horas. Después del período de espera, los investigadores tendrán de millones a mil millones de copias de su ADN de interés. ¿No es asombroso?

Esta es la razón por la que la PCR siempre será una técnica rápida y confiable para generar copias de ADN, en comparación con los métodos utilizados antes de este descubrimiento revolucionario.